Das WIN-Kolleg | 373

noch unklar, ob der Wnt3-Ligand im Endoderm, Ektoderm oder möglicherweise
auch in Kombination mit Komponenten der Mesoglea essentielle Funktionen für
die Initiation des Symmetriebruchs ausübt. Zu diesem Zweck planen wir, eine neu
etablierte Multiphotonen-Mikroskopiestation für konfokale Mikroskopie in tief-
liegenden Geweberegionen zu verwenden. Parallel können Verteilung und Konzen-
tration von umt3::GFP auch durch traditionelle Gefriergewebeschnitte in fixierten
Proben ermittelt werden.
Biofunktionalisierung von Substraten
Die Verwendung von biofunktionalisierten Substraten in diesem Projekt soll zur ein-
fachen und kontrollierbaren Steuerung der darauf kultivierten Zellen und Geweben
dienen. Eine häufig verwendete Funktionalität, um verschiedene Moleküle an die
Membranen zu koppeln, ist das Ni-Chelierer/Histidin-Tag-System, bei dem
Moleküle, die einen His-Tag tragen, an Ankerlipide, die mit einem Ni-Chelierer
(hier NTA) funktionalisiert sind, binden. Die laterale Dichte der gebundenen
Moleküle ist folglich leicht über die Konzentration der Ankerlipide in der Membran
steuerbar. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bestätigt, dass die Membranen
vollständig und homogen über eine Größe von mehreren cm2 waren. Mittels
FRAP-Technologie (Fluorescence recovery after photobleaching) wurde die beste-
hende laterale Beweglichkeit nachgewiesen (Abb. 3 A, B). Bevor Interaktionen zwi-
schen Morphogenen auf der Lipidmembran und tierischem Gewebe untersucht
werden können, muss die Herausforderung gelöst werden, wie das Gewebe in der
Langzeitkultur auf der Oberfläche zur Adhäsion gebracht werden kann. Dafür wurde
em Fusionsprotein aus dem Zelladhäsionsprotein von Cadherin-11 des Xenopus
(Xcad-11) mit His-Tag gewählt und via Ni-NTA-Lipide an die Lipidmembran
gekoppelt. Die Membran wurde danach physikalischen Charakterisierungen unter-
zogen. Die Bindung von Ni2+ Ionen zu den NTA-Lipiden wurde mittels Röntgen-
fluoreszenz untersucht. Dabei zeigte sich ein Konzentrationspeak der Ni2+ Ionen auf
Höhe der Kopfgruppe der Lipide, d.h. wo die NTA-Gruppen an die DOGS-Lipide
gekoppelt sind. Die Bindung des Xcad-11 an die DOGS-NTA-Lipide der Lipid-
membranen wurde mit Hilfe einer Quarzmikrowaage (engl. Quartz Crystal Micro-
balance with Dissipation monitoring = QCM-D, Abb. 3 C) untersucht. Dabei wird
die Frequenzabnahme Af durch die Zugabe von Xcad-11 bestimmt. Die Reversibi-
lität der Ni-NTA/His-Tag-Bindung wurde durch Zugeben des Cheliermoleküls
EDTA bestätigt. Aus Af wurde durch die Formel Am = — CAf/n, mit C = 17.7
ng/(cm2.Hz) und n = Zahl der Oberschwingung, die jeweilige adsorbierte Masse
berechnet. Im Bereich 1—5 mol% DOGS-NTA steigt die adsorbierte Masse linear
mit dem Anteil an Ankerlipiden in der Membran an. Aus der adsorbierten Masse
kann die Anzahl der X-Cad-11 Moleküle abgeschätzt werden und daraus wiederum
der durchschnittliche laterale Abstand <d> zwischen zwei gebundenen Proteinen. In
Abb. 3D sind sowohl die gemessenen Werte von <d> als auch die theoretischen, aus
der Membranzusammensetzung berechneten Werte als Funktion des Mol-% an
Ankerlipiden aufgetragen. Die gemessenen Werte stimmen gut mit den theoretischen