Das WIN-Kolleg
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Kinaseaktivität beeinflusst maßgeblich die gerichtete Migration, wobei „aktive“
PKD die Migration der Krebszellen inhibiert, während kinase-inaktive PKD die
Zellmigration stark steigerte. Ziel dieses Projektes ist es, PKD-kontrollierte Signal-
wege, die für die Migration und Invasion von Krebszellen relevant sind, zu identifi-
zieren. Wir konnten in den vergangenen Jahren zeigen, daß PKD die Migration
durch Phosphorylierung der Phosphatase-Slingshot-1 (SSH1), die an der Kontrolle
von Polymerisations- und Depolymerisations-Prozessen des Aktin-Zytoskeletts
beteiligt ist, kontrolliert. SSH1 reguliert den Aktivitätszustand des ubiquitären
Aktin-Depolymerisations- und „Severing“-Faktors Cofilin durch Dephosphorylie-
rung von Ser3. Die Phosphorylierung und damit Inaktivierung von Cofilin wird
durch die LIMK1 und LIMK2 vermittelt. Dephosphoryliertes cofilin depolymeri-
siert Aktin-Filamente und erzeugt durch „Severing“ neue „barbed ends“ als Nuklea-
tionskerne für die Polymerisation am „leading edge“ in Folge eines gerichteten
Stimulus. Die Aktivität von SSH1 wiederum wird durch PKD über verschiedene
Phosphorylierungen inhibiert (Peterburs et al., 2009; Barisic et al., 2011).
In 2011 haben wir uns überwiegend mit der Regulation der LIMK2 durch
PKD beschäftigt. Hier können wir zeigen, dass PKD-vermittelte Phosphorylierung
von LIMK2 an Serin 289 die Kinaseaktivität positiv reguliert, d.h. Cofilin wird ver-
stärkt durch LIMK2 phosphoryliert und damit inaktiviert (Abbildung 1A und B).
Interessanterweise beeinflusst diese Phosphorylierung die Zelladhäsion negativ.
Unsere Daten zeigen, dass die Expression der wildtypischen LIMK2 Zelladhäsion
stark inhibiert während eine phosphorylierungsdefiziente LIMK2-S289A weniger
starke Effekte aufweist (s. Abbildung ID). Dies zeigt sich auch in der durch LIMK2-
induzierten F-Aktin-Akkumulation: Diese ist in LIMK2-S289A exprimierenden
Zellen deutlich schwächer ausgeprägt (Abbildung IC). Ein Manuskript mit diesen
Arbeiten ist in Vorbereitung und soll nächstes Jahr eingereicht werden.
Darüber hinaus haben wir in 2012 verschiedene Werkzeuge für die Analytik
der PKD-Funktion etabliert. In Zusammenarbeit mit dem Proteomzentrum Tübin-
gen (Prof. Boris Macek) konnten wir in einer globalen massenspektrometrischen
Analyse PKD-abhängige Phosphorylierungsereignisse detektieren (Franz-Wachtel et
al., 2012). DesWeiteren haben wir einen genetisch kodierten FRET-Sensor herge-
stellt, der für die Detektion von PKD-Aktivität in lebenden Zellen geeignet ist (Eis-
ler et al., 2012). In der verbleibenden Förderzeit werden wir diese Werkzeuge nut-
zen, um die Funktion von PKD in der Invasion von Krebszellen zu adressieren. Wir
werden darüber hinaus in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Pacholski die Integration
von Zellen in den optischen Biosensor etablieren.
Herstellung eines optischen Biosensors für die quantitative Bestimmung von extrazellulärer
Matrixdegradation
Um die Quantifizierung von ECM-Degradation zu erleichtern, wird im Rahmen
dieses Projektes ein optischer Biosensor entwickelt. Bisher wurden die Bildung
von Invadopodien und das invasive Potential von Zellen durch einen auf
fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Hierbei werden invasive Tumorzellen auf einer
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Kinaseaktivität beeinflusst maßgeblich die gerichtete Migration, wobei „aktive“
PKD die Migration der Krebszellen inhibiert, während kinase-inaktive PKD die
Zellmigration stark steigerte. Ziel dieses Projektes ist es, PKD-kontrollierte Signal-
wege, die für die Migration und Invasion von Krebszellen relevant sind, zu identifi-
zieren. Wir konnten in den vergangenen Jahren zeigen, daß PKD die Migration
durch Phosphorylierung der Phosphatase-Slingshot-1 (SSH1), die an der Kontrolle
von Polymerisations- und Depolymerisations-Prozessen des Aktin-Zytoskeletts
beteiligt ist, kontrolliert. SSH1 reguliert den Aktivitätszustand des ubiquitären
Aktin-Depolymerisations- und „Severing“-Faktors Cofilin durch Dephosphorylie-
rung von Ser3. Die Phosphorylierung und damit Inaktivierung von Cofilin wird
durch die LIMK1 und LIMK2 vermittelt. Dephosphoryliertes cofilin depolymeri-
siert Aktin-Filamente und erzeugt durch „Severing“ neue „barbed ends“ als Nuklea-
tionskerne für die Polymerisation am „leading edge“ in Folge eines gerichteten
Stimulus. Die Aktivität von SSH1 wiederum wird durch PKD über verschiedene
Phosphorylierungen inhibiert (Peterburs et al., 2009; Barisic et al., 2011).
In 2011 haben wir uns überwiegend mit der Regulation der LIMK2 durch
PKD beschäftigt. Hier können wir zeigen, dass PKD-vermittelte Phosphorylierung
von LIMK2 an Serin 289 die Kinaseaktivität positiv reguliert, d.h. Cofilin wird ver-
stärkt durch LIMK2 phosphoryliert und damit inaktiviert (Abbildung 1A und B).
Interessanterweise beeinflusst diese Phosphorylierung die Zelladhäsion negativ.
Unsere Daten zeigen, dass die Expression der wildtypischen LIMK2 Zelladhäsion
stark inhibiert während eine phosphorylierungsdefiziente LIMK2-S289A weniger
starke Effekte aufweist (s. Abbildung ID). Dies zeigt sich auch in der durch LIMK2-
induzierten F-Aktin-Akkumulation: Diese ist in LIMK2-S289A exprimierenden
Zellen deutlich schwächer ausgeprägt (Abbildung IC). Ein Manuskript mit diesen
Arbeiten ist in Vorbereitung und soll nächstes Jahr eingereicht werden.
Darüber hinaus haben wir in 2012 verschiedene Werkzeuge für die Analytik
der PKD-Funktion etabliert. In Zusammenarbeit mit dem Proteomzentrum Tübin-
gen (Prof. Boris Macek) konnten wir in einer globalen massenspektrometrischen
Analyse PKD-abhängige Phosphorylierungsereignisse detektieren (Franz-Wachtel et
al., 2012). DesWeiteren haben wir einen genetisch kodierten FRET-Sensor herge-
stellt, der für die Detektion von PKD-Aktivität in lebenden Zellen geeignet ist (Eis-
ler et al., 2012). In der verbleibenden Förderzeit werden wir diese Werkzeuge nut-
zen, um die Funktion von PKD in der Invasion von Krebszellen zu adressieren. Wir
werden darüber hinaus in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Pacholski die Integration
von Zellen in den optischen Biosensor etablieren.
Herstellung eines optischen Biosensors für die quantitative Bestimmung von extrazellulärer
Matrixdegradation
Um die Quantifizierung von ECM-Degradation zu erleichtern, wird im Rahmen
dieses Projektes ein optischer Biosensor entwickelt. Bisher wurden die Bildung
von Invadopodien und das invasive Potential von Zellen durch einen auf
fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Hierbei werden invasive Tumorzellen auf einer