16. Juni 2001

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tung wir nicht verstehen. Die flachen, elliptisch geformten Zellkerne menschlicher
Fibroblasten, beispielsweise, zeigen im Vergleich zu Lymphozyten nicht nur einen
auffälligen - und bislang nicht erklärten - Unterschied in ihrer Gestalt, sie zeigen auch
Unterschiede der Anordnung der Chromosomenterritorien. In Fibroblastenzellker-
nen sind HSA 18 und HSA 19 Territorien beide nahe der Kernmitte angeordnet und
beide sind mit der Kernhülle assoziiert. Gleiches gilt für das Y-Chromosom: in Lym-
phozyten befindet es sich am Kernrand, in Fibroblasten in der Kernmitte (Cremer et
al., 2001a). Bei dieser Lage der Dinge sind zunächst weitere deskriptiv-quantitative
Analysen der Chromatinanordnung in verschiedenen Zelltypen einer Spezies, sowie
der Vergleich identischer Zelltypen bei verschiedenen Spezies erforderlich. Auf diesem
Wege wird es gelingen, zelltypspezifische, evolutionär konservierte oder auch spezies-
spezifische Motive der Chromatinanordnung zu identifizieren. Diese Basis muss erar-
beitet werden, wenn wir die funktionelle Bedeutung der Zellkernarchitektur besser
verstehen wollen.
Untersuchungen zur Chromatinanordnung in lebenden Zellen
Der Vorteil von 3D-FISH besteht darin, dass neben kultivierten Zellen auch Zellen in
Gewebeschnitten untersucht werden können. Der Nachteil besteht darin, dass nur
fixierte Zellen untersucht werden können. Als Voraussetzung einer in situ Hybridisie-
rung muss die DNA des Zellkerns einzelsträngig vorliegen. Um dies zu erreichen,
wird in der Regel eine Hitzedenaturierung der DNA vorgenommen, die auch bei
lichtmikroskopisch gut erhaltener 3D Struktur, massive, elektronenmikroskopisch
nachweisbare Veränderungen der Chromatinstruktur bewirkt. Um die Grenzen von
Untersuchungen zur Chromatinanordnung in fixierten Zellen zu überwinden wurde
ein Verfahren entwickelt, mit dem Chromatinanordnungen im Zellkern lebender
Zellen beobachtet werden können. Das Verfahren beruht auf der Einschleusung
fluorochrom-markierter DNA-Bausteine (Nukleotide) in lebende Zellen während der
S-Phase (DNA-Synthese-Phase). Wir verwenden dazu Nukleotide, an die die Fluoro-
chrome FITC (grün), Cyanin-3 (rot) oder Cyanin-5 (infrarot) angehängt wurden. Der
Einbau solcher Nukleotide in die neusynthetisierten DNA-Tochterstränge macht es
möglich, mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops Chromatindomänen („Replikations-
Foci“) mit einem DNA-Gehalt in der Größenordnung von 1 Megabase (1 Mb = 1 Mil-
lion Nukleotide) zu beobachten (Sadoni et al., 1999; Schermelleh et al., 2001). Da das
diploide menschliche Genom etwa 6000 Mb umfasst, sind etwa 6000 solcher Replika-
tions-Foci nötig, um die DNA einer diploiden menschlichen Zelle während der S-
Phase zu verdoppeln. Durch das in vivo Markierungsverfahren wird jedoch nur ein
kleinerer Teil aller Foci sichtbar gemacht. Die so markierten, lebenden Zellen können
im weiteren Ablauf des Zellzyklus, der G2-Phase, in der nachfolgenden Mitose und
durch weitere Zellzyklen hindurch beobachtet werden. Dabei zeigte sich, dass die flu-
oreszenzmarkierten Chromatindomänen in jeder Phase des Zellzyklus beobachtet
werden können. Sie entstehen also nicht, wie es die Bezeichung Replikations-Foci
nahelegt, als Strukturen während der S-Phase neu und werden nach abgeschlossener
Replikatioin wieder aufgelöst, sondern sie sind ständig vorhanden. Um dieser Beob-
achtung Rechnung zu tragen, haben wir den Begriff ~1 Mb Chromatindomänen
geprägt, wobei der Zusatz ~1 Mb nur als Angabe einer Gröflenordnung zu verstehen
ist, die individuellen Chromatindomänen mögen einen DNA-Gehalt zwischen einigen